【摘要】 目的：探讨在实验室模拟远程运输状态下机械振动对改良后甘油长期保存兔角膜内皮细胞（CEC）活性的影响。
方法：通过改良后的甘油保存角膜的方法,实验室中保存兔角膜片3mo,实验室用摇床模拟远程运输环境，结合实际按不同时间、不同振动强度进行分组，分别进行CEC活性染色并行实验性PKP术，对比各组间模拟运输对角膜内皮的影响。
结果：实验条件下观察指标并不随振动强度和时间变化，组间各项指标差异无显著性。
结论：实验室模拟远程投送对甘油长期保存兔角膜的CEC无显著性影响。
【关键词】 角膜移植 甘油 长期保存 远程投送 角膜内皮细胞
0引言
由于我国医疗水平发展的不平衡以及传统观念的影响，我国角膜来源极为匮乏，无法满足当地角膜移植手术需要。对于迫切的需要角膜移植的手术患者，在创建供体角膜眼库长期保存技术以保证角膜贮备的同时，异地保存角膜的长途运输则是缓解现阶段这一不平衡的主要方法。我们经过反复试验获得了简便、实用的甘油长期冷冻保存角膜的方法［1］。本实验通过该方法保存的兔角膜模拟远程投送,并观察角膜内皮细胞(corneal endothelium cell, CEC)活性及PKP术效果，以判定机械震动对CEC活性的影响。
1材料和方法
1.1材料 成年健康新西兰大白兔30只，购自山东省农科院，由我院实验动物中心饲养。其中10只用作PKP供体，另20只用作PKP受体。将医用无水甘油100mL装于敞口无菌的125mL玻璃广口瓶内，置于140℃电热干燥箱（黄骅市御甲综合电器厂）内消毒2h冷却后置于4℃冰箱内备用。做为供体的10只实验动物均采用耳缘静脉空气栓塞处死，获得兔眼球20只。裂隙灯、内皮细胞显微镜观察，角膜健康无损且CEC密度≥2 300个/mm2者纳入本研究。常规眼库处理，运用改良后的甘油长期保存方法［2］，即取下角膜片后在内皮面加入适量1%透明质酸钠，放入消毒备用的纯甘油中，在25℃冰箱冷冻室内长期保存3mo。
1.2方法 参考美国眼库协会（EyeBank Association of America，EBAA）程序手册［2］对角膜组织运输中的包装、密封要求，将甘油长期保存的角膜以防水性能良好的聚乙烯膜包裹密封，放至盛有冰块的冰桶内，同时用塑料泡沫块塞至冰桶内底缓冲振动。以TS1型脱色摇床（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）模拟远程运输所带来的震动环境。时间分组以国内运输可能消耗时间为依据；振动强度分组以国外参考文献［3］为依据，根据摇床的平均加速度，由重力加速度公式：速度v=(2πr)/T，T为一次转动的时间，即振动频率。中心加速度a=v2/r=4π2r/T2，故T2=4π2r/a。得到最大频率为100r/min，我们将此界定为最大频率，在此范围内取较小振动强度30r/min和最大机械振动强度100r/min。将甘油长期保存的角膜片随机以模拟远程投送时间和机械振动强度分组:分组为A组（对照组）：将角膜片装入4℃纯甘油瓶中后立即转存于25℃的冰箱冷冻室，使用时快速复温复水。B组：保存后通过振荡器时间为1h，频率为100r/min。C组：保存后通过振荡器时间为1h，频率为30r/min。D组：保存后通过振荡器时间为5h，频率为100r/min。E组：保存后通过振荡器时间为5h，频率为30r/min。每组各4只角膜。
1.2.1实验性PKP术 自25 ℃甘油中取出保存的角膜片后,立即置于4℃下100mL复方眼内冲洗液中，每2min轻轻涮洗1次，使粘连的甘油洗去，5min后再转置于另一杯相同液体中，再复水5min。然后行实验性PKP手术。手术均由同一术者显微镜下主刀完成。（1）均采用常规角膜移植手术方式；（2）植片与植床大小：使用直径7.5/7.25mm大小；（3）术后给予结膜下注射庆大霉素20kU+地塞米松注射液2.5mg混合液0.1mL，结膜囊内涂典必殊眼膏，30min左右动物苏醒后送动物房。PKP术后给予常规消炎抗感染及抗排斥反应治疗。术后每日肉眼观察植片变化，3，7，14，21，30d裂隙灯常规检查，A超测量角膜厚度。每组在术后30d行植片CEC活性染色检查。
1.2.2锥蓝联合茜素红活性染色检查 保存到期并按分组要求处理后，经复温复水，试验各组与对照组术中取下的角膜环均接受CEC锥蓝茜素红活性染色，参照文献［1］方法配制2.5g/L锥蓝溶液及10g/L茜素红染色剂。然后以装有网格状定量测微尺（购于军事医学科学院）的Olympus光学显微镜进行检查。以细胞核明显蓝染或茜素红斑为CEC死亡标准。每个角膜40倍物镜下取CEC死亡最少的5个视野统计标定面积内的CEC密度、死亡率和异形率并取平均值，以此代表该角膜的最好保存效果。术后1mo时各组取植片每个角膜40倍物镜下随机选取5个视野，计算标定面积内CEC平均密度、细胞脱落区及细胞溶解区面积平均百分比，了解CEC活性情况。
统计学处理：所有数据均经SPSS11.0软件进行方差分析， P<0.05为差异有统计学意义。
[1] [2] 下一页 |
