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2.6结膜下瘢痕胶原定量分析 滤过道狭窄粗细不均匀，不易定量分析，结膜下新生胶原变化趋势与滤过道较为一致，因而采取结膜下瘢痕胶原定量分析代替，结果显示正常结膜下胶原量为21.39±4.87（表2），PBS组与空质粒组无差别，术后7d内胶原量迅速增加，之后缓慢增加至30d大致稳定；MMC组术后7d与术前无差异，此后胶原量增加少而缓，与对照组（PBS组和空质粒组）在各时间点上差异明显（P<0.05），60d内胶原量长期保持在低水平上；cski组术后7d胶原量较术前明显增加，但之后增速减缓，胶原染色面积介于对照组与MMC组之间，与对照组各个时间点上均存在显著差异，与MMC组各时间点（术后14d除外）也存在显著差异，持续至观察结束。
2.7滤过道组织学观察 对照组术后7d滤过道即关闭，其间填充大量细胞和胶原（图5A），此后滤过道内一直为大量胶原填充堵塞，结膜下与巩膜之间新生胶原致密；MMC组滤过道内细胞成分和胶原一直很少，至术后30d滤过道仍然开放，至60d才完全闭塞，各个时间点结膜下胶原纤维稀疏，cski较为特殊，术后7d时滤过道内可见大量细胞填充，但新生胶原成分比对照组少，比MMC组多（图5B），此后各时间点情况均介于对照组和MMC组之间，术后30d，滤过道堵塞，与对照组无太大分别。
表2 滤过术后结膜下胶原阳性染色面积百分比（略）
图3 应用cski术后7d，滤过道内见大量成纤维细胞顺房水流动方向排列(vimentin×400)（略）
图4 兔眼术后7d，滤过道内可见大量肌纤维母细胞,术后14d,应用cski眼滤过道内肌纤维母细胞较应用空质粒眼明显减少(αSMA×400)（略）
图5 术后7d滤过道内浅蓝色胶原纤维和红色的细胞（Mallory×50）（略）
A:PBS处理组;B:cski处理组
3讨论
cski对成纤维细胞作用复杂，有人称其为成纤维细胞增殖的复杂调节子。过量表达时对禽类动物胚胎的成纤维细胞增殖起促进作用，却抑制哺乳动物的成纤维细胞增殖［4］。说明cski与成纤维细胞增殖和分化都有关系。目前认为TGFβ细胞因子途径在瘢痕形成中起重要作用，拮抗该途径就可抑制瘢痕［5］。Smad2 和 Smad3是 TGFβ 途径重要的信号因子，cski是Smad2和 Smad3的辅阻遏因子，因此，cski可以通过TGFβ细胞因子途径来调控组织再生修复过程［6］，可能成为控制瘢痕的新药物。我们以前的研究中观察到cski可以抑制兔耳增生性瘢痕，但滤过手术造成的瘢痕与皮肤增生性瘢痕有所不同，且将cski用于眼部瘢痕治疗是否有效目前国内外均未见有文献报道。滤过术早期失败的的主要原因是由于术后创伤修复，术区滤过道和结膜下成纤维细胞增殖大量分泌胶原纤维所致。青光眼滤过术后切口的愈合过程分为4个时期：(1)凝块形成期：术后12～24h内，各种纤维和血浆成分在切口部位凝聚成块的过程；(2)增殖期：中性粒细胞，淋巴细胞等炎性细胞和血管内皮细胞，成纤维细胞移行进入凝块内的过程。自术后24h开始，5d或6d是成纤维细胞增殖高峰，延续至术后11d 左右。(3)肉芽形成期：术后3～10d，切口可见肉芽组织增生；(4)胶原形成期：由成纤维细胞合成和分泌的胶原，转变为成熟的胶原纤维的过程。成纤维细胞亦变成纤维细胞，毛细血管逐渐退化［7］。我们针对切口愈合的各时期采集标本，并尽量将观察时间延至伤口愈合稳定期，分别以空白手术模型（PBS处理眼）和术后应用抗瘢痕药物（MMC）的模型作为对照观察cski质粒的作用效果。
经各项指标各个时间点观察，空质粒处理眼与PBS处理的对照眼变化均无差异，可以认为空质粒对术后自然病程几乎没有影响，也可视为对照组。术后14d，对照组眼压已回升至术前水平，MMC组眼压自术后7d开始明显降低且回升缓慢，长期保持在较低水平约30d以上，与文献报道一致［8］，cski处理眼降低眼压作用缓慢温和，至术后14d才显出与对照组的差异，持续至30d，降幅和持续时间均不如MMC组。对照组滤过泡术后7d即平复，而MMC组术后7d形成薄壁大滤泡，至21d消失， cski组滤泡形成也明显，变化趋势同MMC组，但滤过泡壁较厚，体积较小，这也间接表明了cski降眼压较MMC温和。对滤泡內炎细胞的观察发现MMC组略少，但各组差异不大，表明cski并非通过减轻炎症来控制瘢痕，不具备糖皮质激素类药物的作用。经vimentin组化染色发现仅MMC明显减少了成纤维细胞的增殖，而cski对术后成纤维细胞的增殖影响甚微，与对照组无差别，这说明cski抑制瘢痕与MMC不同，并非通过抑制成纤维细胞增殖来完成，而是存在其他途径。经αSMA组化染色后观察滤过道内肌纤维母细胞量，发现对照组和cski组滤过道和滤泡腔内肌纤维母细胞在术后7d均有大量增加，14d后cski组的肌纤维母细胞量又较对照组略少，持续至术后30d， MMC组肌纤维母细胞量一直未见大量增加，30d后各组间差异又缩小至不明显。MMC组与对照组之间差异显著，而cski组介于MMC组和对照组之间，与两边各组均无显著差异，目前认为在创伤纤维修复过程中，成纤维细胞可转化为肌纤维母细胞(myofibroblast , MyoF)［9］，而且MyoF合成细胞外基质的作用较成纤维细胞更强，其分泌胶原的能力约是成纤维细胞的3倍，过量的肌成纤维细胞与组织的纤维化有关［10］。我们发现，术后30d内各时间点MMC组与对照组差异明显，而cski组的MyoF量在术后7d与MMC组有明显差异，此后至30d均介于MMC组与对照组之间，统计发现与两边均无太大差异，这表明cski可能有较弱的抑制成纤维细胞转化为肌纤维母细胞的作用。对结膜下胶原定量分析显示与对照组相比，cski术后早期即可抑制胶原分泌，但不作用及MMC，可能与其对成纤维细胞增殖抑制不足有关，术后7d后胶原量增加缓慢，形成的瘢痕较对照组小，有一定的抗瘢痕作用。
总之，100μg剂量cski质粒能减轻滤过术后术区的瘢痕化，可以降低眼压，起效时间约在术后14～30d，术后早期（本实验设为7d）因对成纤维细胞无抑制作用故起效不明显，伤后7d左右是成纤维细胞向肌纤维母细胞转化的时间，据此我们推测cski可能通过两种途径控制瘢痕：(1)直接抑制成纤维细胞和肌纤维母细胞合成分泌胶原；(2)通过减少成纤维细胞向肌纤维母细胞转化间接减少胶原分泌。后者作用可能较弱。总体上cski作用不及0.2g/L MMC，但它不像激素那样抑制免疫，也不像MMC那样使得接触区细胞大面积凋亡，因而避免了诸多的并发症。
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