【摘要】目的： 探讨血清1 型腺相关病毒 (rAAV1) 介导增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白 (GFP)的表达及转染率。
方法：采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒( rAAV1EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型，用含rAAV1EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h，再用此缝线间断缝合，将植片移植到大鼠角膜植床，术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。
结果：按rAAV1EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞。转染后3d，在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达；随MOI值的增高而增强, 转染后7～9d达到高峰,此时检测rAAV1EGFP对角膜基质细胞的转染效率，MOI=103时是16.3%，MOI=104时是30.3%，MOI=105时是43.6%，MOI=106时是47.5%。rAAV1EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。
结论： rAAV1 EGFP 可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞, 是角膜基质细胞理想的报告基因。
【关键词】 腺相关病毒 绿色荧光蛋白质类 角膜基质细胞 基因转染
0引言
眼球是基因治疗的理想靶器官之一，角膜位于体表，有利于基因转移过程的观察。基因治疗的成功取决于外源性基因能否转移到靶组织，并有效地适度表达。其中基因转染成功的关键是基因载体和转染途径的选择。以往有学者尝试过以腺病毒、逆转录病毒或单纯疱疹病毒作为载体,可成功地将外源基因转移到角膜上皮、基质和内皮细胞［1］。但由于这些病毒载体存在致炎、致癌及致基因突变等安全性问题,同时病毒携带的外源性基因片段有一定限制,病毒的包装需特殊处理,因此临床使用存在局限性。目前,重组腺相关病毒载体( rAAV)是非致病性及复制缺陷型的病毒载体,携带的目的基因可在多种组织内长期表达［2］，而且可以高效、稳定地转染分裂期细胞和非分裂期细胞, 并可以长时间表达目的基因, 不诱发细胞毒性和细胞免疫反应, 是迄今为止公认的最安全并具广泛应用前景的病毒载体［3］，利用腺相关病毒的这些特点，我们试图寻找适当的方法和途径将有效的基因转染到角膜细胞中；为各种原因导致的角膜病变，尤其是角膜新生血管和角膜混浊的治疗及抑制高危角膜移植术后排斥反应等转基因治疗提供新的有效途径。
1 材料和方法
1. 1材料 rAAV1EGFP病毒颗粒滴度为2×1012v.g( vector genomes) /mL（由北京五加和分子医学研究所董小岩博士惠赠）；DMEM培养基、胎牛血清( FBS)、胰蛋白酶（美国Gibco公司）。倒置荧光显微镜(Leica Germany)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司, FACS Calibur型) ；体视荧光显微镜（Headquarters公司，加拿大）。SD大鼠和Wistar大鼠(南方医科大学动物实验中心提供)。
1.2方法 取SPF级SD大鼠6只，100mL/L水合氯醛ip麻醉（3mL/kg）后, 眼周消毒,手术显微镜下刮去角膜上皮层，自角膜缘内侧1mm 剪下角膜组织片。刮去后弹力层及内皮层，把漂洗干净的基质剪切成约1mm ×1mm×0.4mm 的小块，加入适量胰蛋白酶0.2g/L溶液，放入37℃，50mL/L CO2 孵箱中过夜。用DMEM 液清洗,清洗后低速离心5min ×2次, 弃上清液后,加入DMEM/ F12培养基,轻柔吹打成混悬液接种于培养瓶，在37℃，50mL/L CO2 饱和湿度培养箱中培养。2d换培养基,以后每3～5d 换培养基,培养持续14d。将二代基质细胞接种于24孔板,共8孔,其中6孔用来转染，2孔留作细胞计数用。培养12h,细胞进入对数增长期后计数；待转染细胞浓度为1×108/L。用无血清的DMEM液将细胞洗2遍,用PBS液将转染液配成1×1011v.g/mL；分别按转染指数(multiplicities of infection, MOI) 1×103，1×104，1×105，1×106v.g/cell进行转染。各设3个复孔，培养基适量稀释,使其能够完全覆盖细胞培养面积，37℃孵育4h后，保留转染液，补充含100mL/L 胎牛血清的培养基,同一批细胞,按照上述方法操作，但不进行病毒转染的(MOI=0)作为对照。转染后第3，5，7，9d于倒置荧光显微镜490nm激发光下观察角膜基质细胞中GFP的表达情况，并照相记录。
1.2.1 rAAV1EGFP转染效率的检测 收集被转染的细胞, 取2 ×105培养细胞,离心,洗涤2 次,震荡细胞,加入10mg/L 多聚甲醛固定, 无需加抗体，直接用流式细胞仪检测角膜基质细胞rAAV1EGFP 的阳性率。
1.2.2穿透性异体角膜移植动物模型的建立 SD大鼠12只双眼作为供体；Wistar大鼠24只右眼作为受体, 供体、受体术前20min以5g/L 托品酰胺滴眼液散瞳，100mL/L水合氯醛ip麻醉(3mL/kg)，眼局部 4g/L倍诺喜表面麻醉（每次间隔10min共4次）；消毒眼周，常规无菌操作,在手术显微镜下上皮刮刀刮除上皮；用3.5mm直径上皮环钻置于角膜中央，转动达基质层；3，6，9点预置缝线；穿刺全层剪下角膜植片。将角膜植片内皮面向上放入小培养皿，用缝线展开植片，在内皮面滴满粘弹剂，在植片周围滴入含有1×1011 v.g/mL rAAV1EGFP的培养液使植片及缝线浸没；用封口胶密闭培养皿后放置37℃保存备用。18h后用3.25mm直径环钻钻除受体角膜中央全层，将浸有转染液的植片置于植床，以浸泡过的缝线间断缝合，无菌气泡形成前房，结膜下注射庆大霉素0.1mL。术毕还纳眼球，金霉素眼膏涂眼，缝合眼睑，术后1d拆除缝线。供体取材后过量麻醉处死。
统计学处理：采用SPSS 11.0统计软件对数据进行处理，组间比较用单因素方差分析，两组比较采用t检验。
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