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2结果
2.1角膜基质细胞rAAV1EGFP的阳性表达 按rAAV1EGFP转染倍数(MOI)为103，104，105，106转染已培养3d的传二代角膜基质细胞。转染后3d，在倒置荧光显微镜下观察到稀少的角膜基质细胞有EGFP阳性表达。起始表达强度不一，随MOI值的增高而增强, 随着时间延长而逐渐增强,转染后7～9d达到高峰，此时倒置荧光显微镜下可见较多角膜基质细胞有EGFP阳性表达（图1）。转染后7～9d达到高峰，流式细胞仪检测rAAVGFP对体外培养角膜基质细胞的转染效率分别为16.3%(MOI=103)，30.3%(MOI=104 )，43.6%( MOI=105)，47.5%( MOI=106)。
图1 rAAV1EGFP转染角膜基质细胞(IF×400)（略）
2.2大鼠异体角膜移植后角膜基质中rAAV1GFP的表达 rAAV1－EGFP转染角膜基质细胞后3d，麻醉后刮除角膜上皮，在体视荧光显微镜观察大鼠异体角膜移植术后角膜植片中开始有微弱表达， 随着时间延长而逐渐增强，转染后7～9d达到高峰，此时在大鼠角膜移植模型角膜植片中的EGFP表达明显增强（图2）。
图2 大鼠角膜移植模型中rAAV1EGFP在角膜的表达（FS×16）（略）
3讨论
随着分子生物学的发展,转基因疗法用于治疗临床上棘手的角膜炎症、变性、外伤及手术导致的角膜病变，尤其是角膜新生血管和角膜混浊的治疗及抑制高危角膜移植术后排斥反应等将成为可能。角膜作为基因治疗的靶组织具有独特的优势,选择一种安全、有效、长期稳定表达的基因载体是基因治疗的关键。以往有学者尝试过基因枪、脂质体、阳离子聚合物，受体以及腺病毒等载体［4-6］ 但它们存在转染效率低，目的基因表达短暂，需重复应用，可诱发机体的免疫反应，以及野生型病毒感染等缺点，限制了其发展。腺相关病毒作为目前最具有应用前景的载体，在对细胞进行转染时具有以下优点［7］：1)细胞毒性低，与目前人类已知的疾病无关；2)不编码病毒蛋白,免疫原性低；3)既可转染分裂细胞，又可转染非分裂细胞；4)可定点与宿主染色体整合；5)病毒颗粒小，可以较容易地透过角膜基质；6)长期转染效果稳定。腺相关病毒重组体在转染宿主细胞后,一个重要的特征就是不会立刻表现出转染效果。在转染初期进入宿主细胞核内的是单链核酸游离体,这是一种无活性的状态。只有在宿主DNA合成酶的作用下合成第二链组成双链核酸游离体时,才会激活目的基因表达。有人也把这种第二链合成的过程称为腺相关病毒重组体转染的限速过程。这个过程可以是数天、数星期甚至是数月,这与腺相关病毒重组体转染的宿主细胞及所处的转染环境有关［8］ 。上述特点正适合于抑制高危角膜移植术后排斥反应和准分子激光角膜上皮瓣下切削术后角膜上皮下混浊等角膜病变的防治研究。
为方便研究观察,我们选择EGFP基因作为报告基因。GFP基因产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察, 在多种苛性条件下都很稳定, 用甲醛固定不影响其荧光的观测［9］，GFP与其他报告基因相比较具有明显的优点［10］：可以实现报告活细胞内的基因表达和基因定位；荧光发射无种属依赖性；荧光为该蛋白的内在属性；荧光信号对光漂白具有高抗性；检测时不需要附加基因产物、底物或辅因子；在细菌及真核细胞中GFP表达无明显毒性作用。Coffin 等［11］的研究表明,GFP 是阳性细胞分选的良好标记物,用流式细胞仪分选出的表达GFP 融合基因的细胞中,GFP 与目的基因的表达一致性为100 %。这些特点使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广泛前景, 被喻为十分有用的活分子探针［12,13］。为此,我们应用GFP 基因作为报告基因,很容易对rAAV 转染角膜基质细胞效率和表达时间进行观察，而且能在荧光显微镜下直接观察, 进行活体细胞的实时定位监测。以EGFP作为报告基因用rAAV对大鼠角膜基质细胞转染的报道很少,我们的研究结果表明:rAAV载体能够满足基因治疗对载体的要求,rAAV不仅能够有效地转染原代培养的大鼠角膜基质细胞,而且在大鼠角膜移植模型的角膜植片中rAAV1GFP阳性表达明显。本研究为进行rAAV介导有效目的基因转染角膜基质细胞治疗角膜病变提供了理论依据。
基因治疗的另一个重要环节是基因转染的途径。Masad等［14］用阳离子脂质体包裹重组质粒报告基因βgal，局部点眼或注射到大鼠视网膜下腔、前房、玻璃体,结果显示,角膜上皮及内皮、虹膜上皮、睫状体上皮、视网膜色素上皮和视网膜神经节的细胞均有报告基因的表达。值得注意的是无论是点眼或是前房注射,均未能从角膜基质细胞中检出报告基因产物,推测可能是由于基质胶原纤维致密排列以及基质细胞过于分散导致基因转染不成功。转染液到达局部病毒滴度过低也可能是基质细胞基因转染未成功的原因之一。我们通过直接用含1×1011v.g/mLrAAV1EGFP的培养基在37℃孵育除去上皮的角膜植片同时浸泡缝线18h，再用此缝线间断缝合，将植片移植到Wistar大鼠角膜植床，使高浓度的rAAV1EGFP直接长时间在角膜基质面弥散,从而实现对角膜细胞的有效转染。用含rAAV1EGFP的培养基孵育除去上皮的角膜植片，再用浸泡过的缝线间断缝合，将植片移植到Wistar大鼠角膜植床。此技术转基因快速、简便,且转染效率较高,安全性好，为各种原因导致的角膜病变，尤其是角膜新生血管和角膜混浊的治疗及抑制高危角膜移植术后排斥反应等转基因治疗提供了基因有效转染的新途径。
【参考文献】
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11 Coffin RS , Thomas SK, Thomas NSB. Pure populations of transduced Primary human cells can be produced using GFP expressing herpes virus vectors and flow cytometry. Gene Ther, 1998;5:718722 上一页 [1] [2] |
