作者：陈凤华 作者单位：首都医科大学附属北京同仁医院眼科中心， 北京 100730
【摘要】 目的 离体培养人Tenon′s囊成纤维细胞，观察其生长特性。方法 将人Tenon′s 囊成纤维细胞进行离体培养及生长抑制实验，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞计数法及MTT法描述细胞生长曲线。并通过免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果 人Tenon′s 囊成纤维细胞离体培养48?h至7?d处于对数生长期。细胞角蛋白染色阴性，波蛋白染色阳性。结论 人Tenon′s囊成纤维细胞在体外易于生长，是细胞离体实验研究的良好材料。
【关键词】 Tenon′s囊 成纤维细胞 细胞培养 青光眼滤过手术
To culture the human Tenon′s capsule fibroblast cells in vitro and to observe its growth property. Methods Human tenon′s capsule fibroblast cells were grown in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum at 370C, 5%CO2, and the medium was changed every third day. Cell proliferation was assayed by counting the cell number and the cell growth curve was drawn. Results Results revealed that from 48 hours to 7 days after seeding the plate, the cells were in the logarithm growth period. The cells were negatively stained with Cytokeratin and positively with Vimentin. Conclusion Human Tenon′s capsule fibroblast cells are easy to culture and are convenient for cell research in vitro.
Key words: Tenon′s capsule; Fibroblasts; Cell culture; Glaucoma filtering operation
1 资料与方法
1.1 标本来源 人眼标本取自我院眼库，于死后6?h内无菌取材，成年男、女各1例，取材后放入冰壶保存，经抗菌处理后1?h内接种。
1.2 主要试剂和仪器 DMEM培养基(美国,GibcoBRL)，胰蛋白酶，胎牛血清(美国,Hyclone)，鼠抗人角蛋白单克隆抗体、鼠抗人波蛋白单克隆抗体（北京，中山生物技术公司）， MTT（美国，Sigma）。 倒置相差显微镜（日本，Olympus），CO2细胞培养箱（德国，Heraeus），酶标仪（美国，BIORAD，Model450）。
1.3 方法
1.3.1 人Tenon′s囊成纤维细胞的原代培养 将无菌取材的Tenon′s囊标本放于4?℃冰盒内带回实验室，浸泡于生理盐水中（内含妥布霉素320?U/mL）40?min，用无菌显微手术剪在超净台内将其剪成2?mm 2大小组织块，接种于培养瓶中，倒置培养瓶，使组织块倒贴于上方瓶底，同时向瓶内小心加入少量DMEM培养基(含10%胎牛血清，100?U/mL青霉素，100?U/mL链霉素)，使培养基既不与组织块接触，又可防止组织块干燥。于37?℃、5% CO2培养箱内培养约4～6?h后，组织块贴附牢固，再将培养瓶复位，使组织块浸入培养基中，继续培养。
1.3.2 人Tenon′s囊成纤维细胞的传代培养 原代细胞培养约2周后，细胞大部分融合，用0.25%胰蛋白酶消化3～5?h，在显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，小心吹打混匀细胞，按1∶3比例接种传代。
1.3.3 人Tenon′s囊成纤维细胞的免疫组化观察 将生长良好的各代成纤维细胞接种于事先放好盖玻片的无菌35?mm培养皿中，生长至80%融合后，取出长有细胞的载玻片，用PBS冲洗，甲醇和丙酮（1∶1）混合液(新鲜配制)固定、免疫组化染色，DAB显色，光镜下观察并照相。
1.3.4 离体培养成纤维细胞生长曲线的测定 ① 计数法。收集生长良好的细胞，消化后以4×104/mL及2×104/mL浓度接种于24孔板中，每孔加样1?mL,每48?h换液一次，分别于1、2、4、6、8、10、12?d，将4孔内的细胞消化下来，台盼蓝染色后，用血细胞计数板计数，取4孔内细胞计数的平均值绘制成细胞生长曲线［3］；② MTT 法。将生长良好的细胞以4×104/mL及2×104/mL浓度接种于96孔板中，每孔100?μL，于37?℃、5% CO2培养箱内培养不同时间，每48?h换液一次，分别于1、2、4、6、8、10、12?d向4孔内加入20μL MTT溶液，37?℃、5% CO2培养箱内孵育6?h，每孔加入100?μL 20%SDS50%DMF,室温下振荡30?min，酶标仪测定各孔吸光度（OD值），最大吸收波长600?nm。将各孔细胞计数的平均值绘制成细胞生长曲线。
2 结 果
2.1 培养人成纤维细胞的形态特征 原代培养的人Tenon′s囊成纤维细胞组织块接种后，约3天即可见细胞由组织块中游离出来，在2～3周长满融合，镜下呈紧密排列的单层长梭形贴壁细胞(图1～2)。细胞对胰酶消化敏感，传代细胞用0.25%胰酶37?℃消化3～5?min，大部分细胞即收缩变圆，易于吹打下来。传代细胞接种后4?h大部分细胞贴壁，1周长满融合(图3～4)。
2.2 培养人成纤维细胞的免疫组化鉴定 体外培养的人Tenon′s囊成纤维细胞经免疫组化SP法染色可见角蛋白染色阴性(图5)，波蛋白染色阳性(图6)，阳性细胞胞浆内可见与细胞长轴方向一致的棕黄色束状或网状结构。染色呈阴性，胞浆内无着染物质角蛋白染色
呈阳性，胞浆内可见棕黄色着染物质波蛋白染色
2.3 培养细胞生长特性观察 用计数法及MTT法做的细胞生长曲线基本一致(图7～8)。由曲线可见，细胞在2～8?d处于对数生长期。
[1] [2] 下一页 |
