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3 讨 论
3.1 本研究的意义 眼部的许多增殖性疾病(如青光眼滤过术后、翼状胬肉、角膜瘢痕形成等)都与效应细胞——成纤维细胞的过度增生有密切的关［4］。Tenon′s囊成纤维细胞过度增殖导致滤过口阻塞是青光眼滤过手术失败的主要原因，因此，成纤维细胞的成功培养是上述纤维增殖性疾病研究的前提和基础。人和动物的组织由于物种差异，细胞生长难易也有差别。动物组织取材方便，其组织细胞离体培养相对要容易些。但由于将来主要应用于对人类疾病的研究，如果条件许可尽量取用人的组织进行研究。有关人Tenon′s 囊成纤维细胞的培养方法已有报道，方法各有特点，深入探讨Tenon′s 囊成纤维细胞的培养方法、优化Tenon′s 囊成纤维细胞的培养方式，可为进一步抗瘢痕研究奠定基础。
3.2 人Tenon′s囊成纤维细胞的离体生长特点及细胞鉴定 本研究发现，在细胞离体培养中，用组织块培养法培养人Tenon′s囊成纤维细胞，细胞较易于生长，不需要特殊条件，采用DMEM培养基（含10%胎牛血清）常规培养即可。多数细胞长满时呈梭形［5］。
细胞质内的中间丝状蛋白是鉴定细胞的有用指标之一。目前发现至少有5个亚组的丝状蛋白质分布具有组织类型的特异性。如大多数组织的上皮细胞含有细胞角蛋白，间质细胞含有波形蛋白Vimentin（它是一种中等纤维成分）［6］。成纤维细胞属于间质细胞，因此细胞角蛋白染色阴性，波形蛋白染色阳性。再结合细胞生长的形态学特征，可证明是成纤维细胞。
通过细胞生长曲线可见，传代细胞在接种后48?h至1周，细胞生长旺盛，为对数生长期，细胞实验多选在此期内进行。
3.3 细胞生长曲线的测定 除了通过传统的细胞计数法测定细胞生长曲线外，本研究也尝试通过MTT法检测细胞的生长状态，并与细胞计数法进行了比较。MTT法检测细胞增值的原理是：细胞增殖时能量代谢活跃，能量代谢的水平与细胞合成DNA的水平基本一致。因此，测定细胞能量代谢水平可以间接反映细胞增殖的情况。活细胞特别是增殖期细胞可通过线粒体能量代谢过程中琥珀酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状甲瓒沉积于细胞内或细胞周围，而形成甲瓒的量与细胞增殖程度成正比［7］。我们发现，用MTT 法检测细胞增值与计数法结果非常一致，可以认为MTT法也可作为检测细胞生长状态的间接方法。
3.4 关于人Tenon′s 囊成纤维细胞离体培养的几点体会 ①细胞原代培养采用组织块培养方法较细胞消化法简便，不需要胰酶消化，也避免了因消化时间过长导致的细胞生长不良。但组织块要尽量剪碎，如果组织块过大，细胞不易游出且组织块容易脱落；②我们对促进组织块贴壁的方法做了一点改进，即采用湿房的方法。当把剪碎的组织块均匀放入培养瓶底后，可将培养瓶倒置，加入少量培养基，使组织块处于湿房中，待组织块贴壁完全后，再将培养瓶翻转至正位进行组织块培养。这样即有利于使组织块尽快贴壁，又避免了组织块干燥，使细胞培养更容易存活；③人Tenon′s囊成纤维细胞离体培养时，取材的组织要尽量新鲜，采用1640或DMEM培养基均可，向培养基中加入10%的胎牛血清即可使细胞较易于生长。在此基础上适当上调或下调胎牛血清的量，可使细胞生长速度相应加快或降低。原代培养换液不要太频繁，更不利于细胞生长。传代培养因细胞生长较快，可3?d更换一次培养液。每次加入培养液要适量，过多容易造成污染。参考文献:
【参考文献】
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［7］ 郑永唐，贲昆龙.测定细胞存活和增殖的方法的建立［J］.免疫学杂志，1992，8（4）：266269. 上一页 [1] [2] |
