作者：李旭 王桂云 张晓光 作者单位：吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041
【摘要】 目的 通过大鼠内层视网膜缺血再灌注（IR）过程中细胞凋亡的检测，探讨视网膜IR的病理机制。方法 采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术，检测大鼠视神经结扎致视网膜中央动脉阻断引起的大鼠内层视网膜IR损伤导致的视网膜细胞凋亡。结果 视网膜细胞凋亡自视网膜IR 3 h后出现，逐渐增多，一直持续存在至 24 h，然后下降，至48 h减少，而在正常和缺血组视网膜上没有凋亡细胞的出现。结论 视网膜IR所引起的病理过程不仅是循环障碍，更是视网膜神经元的变性过程。
【关键词】 视网膜；缺血再灌注；凋亡
视网膜组织不仅是视觉系统的组成部分，也是神经组织的一部分，对缺血、缺氧的耐受性较差，反应敏感。对脑缺血再灌注（IR）损伤的研究发现，一些神经元具有选择性受损伤能力，大脑中易受损伤的细胞位于皮质的Ⅲ、Ⅴ层和海马回的CA1和CA4区〔1〕。在视网膜组织中相似的现象也在起作用，节细胞可能是敏感的细胞群〔2〕。本实验采用原位凋亡方法，即末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL），检测大鼠视神经结扎致视网膜中央动脉阻断引起的大鼠内层视网膜IR损伤所致的视网膜细胞的凋亡情况，为了解视网膜IR的病理机制，更好的预防缺血所引起的损害奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 动物及模型制备 根据Otori等〔3〕提供的方法，选取45只健康Wistar大鼠（解放军军需大学动物部提供），雌雄不限，无眼疾，体重在200～250 g之间。将动物随机分为9组，每组5只大鼠。包括正常对照（N）组，缺血组（I），再灌注（R）3、6、9、12、24、48和72 h组。所有大鼠均采用右眼为实验对象。
采用戊巴比妥钠3 ml/kg腹腔麻醉，沿角膜缘环形剪开球结膜，分离结膜下组织，暴露4条直肌及视神经，从4条直肌之间穿过60丝线，使之环绕视神经。
N组不结扎丝线；其余各组均用丝线活结结扎视神经，从瞳孔观察眼底血流中断，变苍白，造成视网膜缺血。维持此状态60 min，立即摘除眼球为I组；其余各组松开结扎线，形成再灌注，分别于3、6、9、12、24、48和72 h摘除眼球，分别为R3、R6、R9、R12、R24、R48和R72组。
1.2 方法 眼球摘除后，用安全刀片自角膜至视神经纵向剖开，去前节和玻璃体，固定于4%的多聚甲醛溶液中，4℃24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋成蜡块。所有标本制成5 μm的切片。每例标本间隔100 μm选取1张切片，共4张进行TUNEL染色。组织切片脱蜡至水，0.3% H2O2封闭60 min，滴加蛋白酶K，37℃2 h，加入TUNEL液（即末端转移酶）（鼎国公司），37℃1 h，马血清封闭，室温60 min，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素37℃1 h保温孵育，用二氨基联苯胺显色。显微镜下观察，细胞核呈棕黄色，细胞膜和浆无明显特异性染色的切片进行阳性细胞计数。
1.3 检测指标 400×视野下计数阳性细胞个数，平均每个视野含视网膜节细胞层（ganglion cell layer,GCL）12～24个，共选取5个不同的视野区，计数阳性细胞总数。
1.4 统计学处理 结果进入Instat统计学软件，得出IR损伤各个不同时相TUNEL阳性细胞计数，并给出直方图。
2 结果
在视网膜IR损伤大鼠动物模型的不同时相上，相对于正常对照组视网膜可以观察到TUNEL阳性的细胞，表现为细胞核呈现棕黄色的染色。IR损伤各个不同时相的5个标本的4张不同切片上，随机选取的5个不重复视野的阳性细胞总数见表1。GCL染色IR损伤48 h及INL染色IR损伤3 h阳性细胞数偶见，两种染色IR损伤72 h见不到阳性细胞。
2.1 对照组和缺血组TUNEL染色 对照组的视网膜组织上没有TUNEL阳性细胞的表达。在缺血组同样未见到TUNEL阳性细胞。
表1 IR损伤各个不同时相TUNEL阳性细胞计数（略）
2.2 视网膜GCL染色 在再灌注3 h组，可见GCL细胞出现阳性染色，再灌注6、9 h，阳性细胞数逐渐增多至最高峰，12、24 h阳性细胞数逐渐减少，至再灌注48 h偶尔可见散在的阳性细胞，而再灌注72 h见不到阳性表达(图1、图2)。
图1 大鼠视网膜IR 9 h（TUNEL染色，×400）（略）
图2 大鼠视网膜IR 24 h（TUNEL染色，×400）（略）
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