作者：李文静 作者单位：(832002)中国新疆维吾尔自治区石河子市，石河子大学医学院
【摘要】 探讨诱导供体特异性的前房相关免疫偏离(anterior chamberassociated immune deviation，ACAID)对高危角膜移植排斥反应的影响。方法：采用新西兰白兔眼角膜建立碱烧伤眼模型，实验动物随机分为4组，A：正常角膜常规角膜移植组(正常对照组)；B：碱烧伤常规角膜移植组(碱烧伤对照组)；C：正常角膜诱导ACAID的角膜移植组(正常诱导组)。D：碱烧伤后诱导ACAID的角膜移植组(碱烧伤诱导组)。B，D组进行左眼碱烧伤，烧伤后1mo进行角膜移植。C，D组在角膜移植前2wk于右眼前房注入可溶性抗原以预先诱导供体特异性ACAID。A，B组右眼前房注等量平衡盐溶液。术后记录植片存活时间；对角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)生长情况进行评分；记录移植排斥指数(rejection index，RI)；角膜固定、包埋后制作切片行HE染色。结果：A、C组角膜植片长期存活，碱烧伤对照组植片平均存活25.13±0.64d，碱烧伤诱导组角膜植片平均存活时间为38.25±1.28d。与碱烧伤对照组相比，碱烧伤诱导ACAID组角膜植片平均存活时间显著延长，两组植片存活时间的差异具有统计学意义(P=0.00)。结论：诱导供体特异性ACAID可以延长碱烧伤高危眼角膜植片的存活时间。
【关键词】 免疫偏离 穿透性角膜移植术 碱烧 排斥反应
0引言
角膜病是人类仅次于白内障的主要致盲性眼病，80%的角膜盲患者可以通过角膜移植达到复明的目的[1]，移植排斥是目前导致角膜移植手术失败的主要原因，特别是严重血管化（如各种感染、化学和热烧伤后）、重复移植、大植片、全角膜或角巩膜等高危状态的移植患者[2]。随着移植学实验及临床实践的发展，角膜移植排斥的防治已经融入了新观念。在保持受者正常免疫应答能力的情况下诱导供体特异性免疫耐受较单纯应用免疫抑制剂能获得更长期的植片存活。近年来人们发现，接种于正常眼前房中的抗原可以使受体的全身免疫反应发生独特改变，此现象被称为前房相关免疫偏离(anterior chamberassociated immune deviation, ACAID)[3]，其特征是选择性地抑制抗原特异性的迟发型超敏反应（DTH）。本研究利用可溶性抗原前房注入正常兔眼前房诱导了供体特异性的ACAID，预先诱导供体特异性ACAID将可能有助于高危角膜植片的存活。
1材料和方法
1.1材料
新西兰白兔(new zealand rabbit, NZW)40只和家兔16只由新疆自治区实验动物中心提供，雄性，体质量2.0～2.5kg，动物在兰州军区乌鲁木齐总医院重点实验室动物饲养中心饲养，符合association for research in vision and ophthalmology, ARVO)有关研究目的动物的相关规定。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自Merk公司，完全弗氏佐剂(complete Freunds adjuvant，CFA)购自Sigma公司，试剂配制由本实验室与兰州军区乌鲁木齐总医院重点实验室合作配制，将BSA溶解在平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)中，分别配制5g/L和0.5g/L浓度的溶液，微孔滤膜（0.22nm）过滤除菌，分装后冻存，分别用于眼前房接种、皮下免疫和皮内注射测定DTH反应。将CFA与5g/L BSA溶液等量充分混合成油包水乳剂。眼科手术显微镜(TOPCON)；眼科显微手术器械(苏州明仁器械有限公司)；裂隙灯显微镜(TOPCON)。16只健康新西兰白兔中随机数字法分为2组：A组：正常角膜常规角膜移植组(正常对照组)8只；C组：正常角膜诱导ACAID的角膜移植组(正常诱导组)8只。16只健康新西兰白兔成功建立高危角膜移植术后模型，应用随机数字法分为2组:B组：碱烧伤常规角膜移植组(碱烧伤对照组)8只；D组：碱烧伤后诱导ACAID的角膜移植组(碱烧伤诱导组)8只。B，D组进行左眼碱烧伤，烧伤后1mo进行角膜移植。C、D两组在角膜移植前2wk于右眼前房注入可溶性抗原以预先诱导供体特异性ACAID，A，B组右眼前房注等量平衡盐溶液。
1.2方法
40只新西兰白兔中随机数字法选取24只兔进行角膜新生血管化模型的制作，肌注盐酸氯胺酮(50mg/kg)和盐酸氯丙嗪(25mg/kg)，联合5g/L盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，选择兔左眼制作模型，取1mol/L的NaOH溶液30μL滴于6mm直径的无菌干燥滤纸片上，1min后将滤纸片轻轻置于兔左眼瞳孔中央烧灼1min后取下，立即用20mL的PBS(pH值=7.4)冲洗烧伤区及结膜囊1min。选择新生血管达角膜中央的兔(16只)左眼用于实验，烧伤后1mo进行同种异体角膜移植。前房注入可溶性抗原诱导ACAID的麻醉方法同前，健康新西兰白兔行前房穿刺，将100μL 5g/L的BSA溶液注入诱导组兔前房[4]，对照组兔前房注入等量BSS。术后每日2.5g/L氯霉素眼液1次，持续1wk。穿透性角膜移植术(penetrating keratoplasty，PKP)的麻醉方法同前，参照Williams方法[5]，取健康家兔作为供体，供体角膜钻取直径为7.75mm，用7.5mm环钻制备植床。用100尼龙线间断缝合16针，水密形成前房，术后结膜下注射0.2mL妥布霉素(4g/L)，抗生素眼膏涂眼。术后每天滴2.5g/L氯霉素眼液1次，持续1wk。表1碱烧伤诱导组与碱烧伤对照组植片存活情况（略）
1.2.1碱烧伤术后角膜新生血管生长情况
碱烧伤术后2d起在裂隙灯显微镜下观察角膜新生血管情况，每日1次，连续观察2wk以上。对角膜新生血管生长情况进行评分。由2人同时观察评分。评分标准:0:没有血管；1:在角膜周边区域(角膜缘以内lmm)可见新生血管；2:血管生长侵入角膜缘以内lmm；3:血管到达角膜中央。角膜的每个象限独立记分，4个象限的总和为该新西兰白兔CNV评分。
1.2.2穿透性角膜移植术后角膜植片存活状态
自穿透性角膜移植术后2d开始，每日在裂隙灯下观察受体兔角膜植片存活状态，参考Larkin等[6]制定的标准，由2人分别评分，以角膜透明度、水肿度、新生血管度为指标，单独计分，记录移植排斥指数(rejection index，RI)(010分)。0分：植片完全透明，无水肿及新生血管形成；1分：植片透明度轻度丢失，中度水肿，在植片任何一个象限内血管侵入半径的25%；2分：透明度中度丢失，虹膜纹理可见，伴有植片增厚的显著水肿，在植片任何一个象限内血管侵入半径的50%；3分：虹膜纹理不可见，但瞳孔轮廓可见，在植片任何一个象限内血管侵入半径的75%；4分：瞳孔轮廓不清，在植片任何一个象限内血管侵入角膜中央。评分之和为RI，当RI≥5或植片混浊一项达到3时，即认为排斥反应发生；记录各组角膜移植片的存活天数。
1.2.3组织学检查
碱烧伤角膜取自手术中从受体眼钻取的角膜片，立即置于福尔马林固定液中固定。标本进行脱水、包埋、切片和苏木精伊红染色。角膜植片观察期满，摘除眼球，处理方法同上。每份标本石蜡切片均取一张常规HE染色，光学显微镜下观察兔角膜新生血管化、角膜移植后及正常兔角膜组织、形态学改变。
统计学处理：用SPSS13.0 for windows 软件分析，所有资料采用±s表示，两组计量资料之间均数比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
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