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2.3 共同培养系统的CD80、CD86和CD154表达
CD80/CD86、CD40和它的受体CD154是HLA信号系统之外的第二信号系统，是T细胞增生和细胞因子分泌所必需的条件。在共同培养系统中，CD80和CD86均可被观察到阳性表达，却无CD154阳性细胞，见表2。表2 角膜上皮细胞和PBMC共同培养体系中的CD80、CD86和CD154的表达（略）
2.4 荧光辅助细胞筛选分析（FACS）
CD69作为活化的T淋巴细胞的标记物，在PBMC和角膜上皮细胞共同培养之后被测定。最高水平的应答反应在PBMC与γ干扰素预先诱导的角膜上皮细胞共同孵育系统中被检测到，见图3。
3 讨论
临床上，角膜移植的排斥反应多数被认定为角膜内皮功能的失代偿。在此研究中，我们探讨了角膜上皮细胞的培养以确定它们在体外作为潜在的抗原递呈细胞的分子表达和能力。至今，尚缺乏对这些细胞的功能和免疫学特性的定义。
第一信号：HLA Ⅱ类抗原。我们发现HLA Ⅱ类抗原表达在未受诱导的人角膜上皮细胞上，且能够被γ干扰素提高其表达。实验性鼠角膜移植模型显示可诱导新生血管化和淋巴排泄通道发展的外界刺激也可以提高淋巴细胞的活化［9］。本研究中，我们发现排斥反应的移植片增厚，同时有新生血管长入，并有HLA Ⅱ类抗原表达阳性的细胞浸润。免疫淋巴细胞可以沿着这些新形成的血管从淋巴结循环至角膜并破坏免疫赦免状态，从而导致移植失败，植片被排斥。
第二信号：共同刺激通路。CD154：CD40通路在细胞介导的免疫反应的生成中是重要的，并且被认为是T细胞活化过程中的关键通路［10］。CD40被发现是抗原递呈细胞和间叶细胞的变种，包括B淋巴细胞、树枝状细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和上皮细胞［1114］。CD154是CD40的配体(CD40L)，是肿瘤坏死因子(TNF)家族成员。CD154和CD40结合诱导了信号通道的开启，从而导致CD80和CD86的表达升高［1517］。动物实验模型显示，阻断CD40：CD154通路足以诱导Th1介导的接触性超敏反应耐受， 从而有效地延长植片的存活率［1822］。
两条证据强调了在移植排斥过程中，T细胞共同刺激通路中B7：CD28通路的任务。首先，体外药物阻断B7和CD28分子之间的反应，可诱导T细胞递呈同种抗原长时间持续的无反应性应答。其次，在血管化的器官移植后，B7分子可在24小时之内被诱导在血管内皮上，意味着T 细胞能够通过移植的器官本身接受共同刺激信号［23］。实验证明同种角膜移植术后结合抗CD80和抗CD86单克隆抗体治疗可有效地延长角膜移植片的存活［24］。这些结果说明了CD80和CD86共同刺激分子在角膜移植排斥反应中的重要作用。
角膜各层的排斥反应可各层独立发生，也可同时混合发生［25］。 通过共同培养研究得出结论，PBMC和角膜上皮细胞之间的接触可促进共同刺激分子在角膜细胞上的表达。荧光辅助细胞筛选分析和免疫组织化学染色显示人角膜上皮细胞刺激T淋巴细胞表达高水平的CD69。T细胞受体识别角膜上皮细胞上的HLA/多肽复合体得到信号1，同时， 提供CD28抗体以结合角膜细胞上的CD80或CD86分子，得到信号2。信号1和信号2导致了T细胞活化和增生的阳性刺激。同理作用于CD40CD154第二通路。本研究阐述了角膜移植排斥反应的机理以及角膜上皮细胞作为潜在抗原递呈细胞的功能，供体角膜上皮细胞和受体T淋巴细胞的接触触发了移植片的同种免疫性反应，最终作用于角膜内皮细胞，导致内皮水肿，功能失代偿，移植失败。
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